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112018-07

基因合成

基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术,与寡核苷酸合成有所不同:寡核苷酸是单链的,所能合成的最长片段仅为100nt左右,而基因合成则为双链DNA分子合成,所能合成的长度范围50bp-12 kb。通过基因合成,可以获得自然界中不存在的基因,且相对于从已有生物中获取基因来说,基因合成无需模板,因而不受基因来源限制。


原理

DNA 合成的方法主要采用固相亚磷酰胺三酯法,运用此方法的 DNA 合成仪有很多,常用的有 ABI 394 合成仪、ABI39OO 高通量合成仪,它们的区别主要在合成效率,试剂用量,耗时等方面,合成的原理是相同的,合成原理如图:

 

(1) DMTro是5’羟基的保护基团,用TCA(三氯乙酸)和预先连接在固相载体(CPG)上的核苷酸的5’端发生反应,脱去DMT,使5’羟基端游离

(2) 亚磷酰胺保护的dNTP和活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,此时3’端被活化,5’-羟基被DMTro保护

(3) 1、2步的产物发生缩合反应偶联,形成新键C-亚磷酯键

(4) 1中会剩下部分未参与反应的5’-羟基,通过乙酰化的方法封闭5’-羟基

(5) 3步形成的C-亚磷酯键不稳定,易被水解,所以用氧化剂碘将其氧化成更稳定的磷酸三酯键

通过以上步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体上,将其5’端的DMTro切除,重复以上步骤合成所有需要的碱基,最后经过氨水高温处理,将合成的链从固相载体CPG 上切下来,根据不同的下游应用纯化处理后保存。

 

基因合成的优点

(1) 合成周期短,可以保证序列的100%正确无误

(2) 基因合成具有更大的灵活性,可以对基因的酶切位点和基因序列进行修改,方便下游的克隆和实验

(3) 研究人员根据自己的意愿设计得到自然界中很难获得甚至不存在的基因

(4) 基因合成的基因可以进行密码子优化,使基因在各种生物表达体系中都能得到良好表达

 

基因合成的应用

(1) 克隆人鼠抗体或重组抗体

(2) 合成不同的基因突变株、SNPS、或其它突变株

(3) 设计合成DNA疫苗

(4) 大量合成用于微芯片的cDNA